Qu'est-ce que la spectroscopie de fluorescence ?

Par Paul Heney | 3 mai 2023

La spectroscopie de fluorescence est une méthode permettant de déterminer la composition d'un échantillon. Il excite un échantillon avec un rayonnement électromagnétique, le faisant émettre un rayonnement caractéristique. Il s'agit d'une méthode non destructive d'analyse de la composition des échantillons. Les instruments utilisés pour effectuer la spectroscopie de fluorescence sont appelés fluoromètres. Le plus souvent, l’échantillon est excité à l’aide de lumière ultraviolette et la lumière émise se situe dans le spectre visible. Les fluoromètres à rayons X sont également utilisés pour l'analyse élémentaire. La spectroscopie de fluorescence est utilisée dans de nombreux domaines, notamment la biochimie, la médecine et la qualité de l'eau.

La fluorescence est un processus par lequel des substances absorbent et réémettent un rayonnement. Les molécules ont différents niveaux d'énergie déterminés par la position des électrons dans les coquilles et les états vibrationnels. Lorsqu’une molécule est excitée en absorbant un photon de rayonnement électromagnétique, elle stocke momentanément cette énergie en passant à un état d’énergie plus élevé, un électron se déplaçant vers une coque plus éloignée du noyau. En raison de l’attraction électrique entre l’électron et le noyau, l’électron retombe rapidement à l’état d’énergie inférieur et l’énergie est libérée sous forme de photon. Ces photons libérés constituent le rayonnement réémis – et ils ont une fréquence caractéristique de l’état vibrationnel unique de la molécule.

La spectroscopie de fluorescence peut être réalisée par des fluoromètres à filtre ou des spectrofluorimètres. Les fluoromètres à filtre utilisent des filtres pour séparer le rayonnement d'excitation de la lumière fluorescente émise. Les spectrofluorimètres utilisent un monochromateur à réseau de diffraction pour séparer l'excitation et la lumière fluorescente. Dans les deux cas, la source d'excitation émet un rayonnement à large spectre et la bande de fréquence est ensuite rétrécie par un filtre ou un monochromateur avant d'atteindre l'échantillon. La fréquence de la lumière fluorescente est ensuite déterminée en la faisant passer à travers un autre filtre ou monochromateur et photodétecteur. L’échantillon sera fluorescent dans toutes les directions, quel que soit l’angle du rayonnement d’excitation incident. Le détecteur est donc normalement positionné perpendiculairement au faisceau d'excitation afin de minimiser la lumière transmise ou réfléchie atteignant le détecteur.

La source de lumière d'excitation peut être une lampe à vapeur de mercure, un arc au xénon, une LED ou un laser. Un avantage de l’utilisation d’un laser est que la bande de fréquences très étroite supprime le besoin d’un monochromateur ou d’un filtre d’excitation. Cependant, cela rend le réglage de la fréquence beaucoup plus difficile et quelque peu limité. Un monochromateur doté d'un réseau de diffraction et de filtres de polarisation à balayage mécanique peut être ajusté pour balayer une large gamme de longueurs d'onde.